生物技術(shù)在蔬菜育種上的應(yīng)用

從20世紀(jì)70 年代開始以細(xì)胞工程和基因工程為主體的現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于作物品種改良，把育種技術(shù)從宏觀水平提高到微觀水平。生物技術(shù)應(yīng)用于蔬菜育種，是生物技術(shù)與常規(guī)育種的有機(jī)結(jié)合，具有創(chuàng)造變異多、育種目的性強(qiáng)、育種時(shí)間縮短、后代選擇穩(wěn)定快等優(yōu)點(diǎn)，為培育高產(chǎn)、高抗、多抗、品質(zhì)優(yōu)良的新品種提供了科學(xué)的手段。
1 應(yīng)用現(xiàn)狀
1.1 細(xì)胞工程在蔬菜育種上的應(yīng)用
    細(xì)胞工程是以細(xì)胞為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為地使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意志發(fā)生改變，從而改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速動(dòng)物和植物個(gè)體的繁殖，或獲得某些有用的物質(zhì)的過(guò)程。在蔬菜育種技術(shù)方面主要有植物離體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、人工種子等幾個(gè)方面。
1.1.1 植物離體培養(yǎng)技術(shù)
    植物離體培養(yǎng)包括胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織或愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等，是目前植物細(xì)胞、組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多、最有效的一種快速生產(chǎn)脫毒種苗的手段。其主要用于擴(kuò)大變異范圍、加速親本材料的純化、加速無(wú)性繁殖、獲得脫毒苗、種質(zhì)資源試管保存等。在蔬菜上已成功運(yùn)用離體培養(yǎng)技術(shù)的國(guó)家有中、日、美、法、英、荷等10多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。涉及的蔬菜品種有茄科的番茄、馬鈴薯、辣椒、茄子、甜椒等；十字花科的結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜、青花菜、花莖甘藍(lán)、孢子甘藍(lán)、芥菜、大白菜、小白菜、蘿卜等；傘形花科的胡蘿卜、芹菜、香芹菜等；葫蘆科的黃瓜、西葫蘆、甜瓜等；豆科的菜豆、豌豆等；菊科的萵苣、苦苣等；石蒜科的洋蔥、韭菜、大蒜等幾十種作物。在我國(guó)馬鈴薯、大蒜、姜等無(wú)性繁殖蔬菜莖尖脫毒快繁方面，已經(jīng)形成了可靠的技術(shù)體系和可行的良繁體系，其中應(yīng)用最成功、最廣的是馬鈴薯脫毒、利用微型薯繁殖無(wú)病毒原種等。
1.1.2 花藥培養(yǎng)技術(shù)
    花藥培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下取出充滿花粉的花藥，置于適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由花粉再分化出植物的方法�；ǚ叟c植物體的其它部位不同，染色體僅為體細(xì)胞的一半，故由其所分化的植物，其體細(xì)胞也是單倍體。從雜種的花粉再分化出的植物體進(jìn)行加倍處理，可直接得到遺傳上穩(wěn)定的二倍體植物。此項(xiàng)技術(shù)從1964年印度學(xué)者Guha和Maheshwari成功地將毛葉曼陀羅的成熟花藥離體培養(yǎng)獲得單倍體植株以來(lái)，得到了快速發(fā)展。離體花藥在培養(yǎng)條件下可經(jīng)器官發(fā)生途徑或胚胎發(fā)生途徑分別產(chǎn)生單倍體植株，最早的花藥培養(yǎng)再生單倍體植株是經(jīng)胚狀體途徑形成的，蔬菜中辣椒、茄子、大白菜等植株較易形成花粉胚，而蘆筍、番茄等多經(jīng)器官發(fā)生途徑形成單倍體植株。我國(guó)于1970 年開始在單倍體育種方面進(jìn)行研究，目前已有40 種以上植物的花粉或花藥發(fā)育成單倍體植株，主要集中在十字花科的結(jié)球白菜羽衣甘藍(lán)、蕪菁和蘿卜、茄科(辣椒、馬鈴薯)和葫蘆科的黃瓜，其中辣椒、甜菜、白菜等的單倍體植物為我國(guó)首創(chuàng)。
1.1.3 原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交技術(shù)
    原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交育種原生質(zhì)體培養(yǎng)是細(xì)胞工程的核心內(nèi)容，在植物快速繁殖、遠(yuǎn)緣遺傳重組、轉(zhuǎn)移基因尤其是多基因控制性狀，以及在創(chuàng)造新類型及品種改良上具有廣闊的應(yīng)用前景。1960 年，英國(guó)Cooking 首先從番茄莖尖細(xì)胞分離到原生質(zhì)體，同時(shí)也是世界上首先分離到植物的原生質(zhì)體。至今蔬菜作物可供作原生質(zhì)體分離，培養(yǎng)、植株再生、細(xì)胞融合等試驗(yàn)的已有14 個(gè)科的幾十種作物，已獲得體細(xì)胞雜種蔬菜有馬鈴薯+番茄、白菜+甘藍(lán)、蘿卜+油菜，以及胡蘿卜+香芹等。我國(guó)科學(xué)家在蔬菜原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合領(lǐng)域內(nèi)也取得很大的進(jìn)展，先后由原生質(zhì)體培養(yǎng)而獲得再生植株的蔬菜品種有紫紅蘿卜、黃瓜、甘藍(lán)、芥菜和胡蘿卜等。體細(xì)胞雜交，為克服植物有性雜交不親和性、打破物種之間的生殖隔離、擴(kuò)大遺傳變異等提供了一種有效手段。自1972 年獲得世界上第一個(gè)植物體細(xì)胞雜種煙草細(xì)胞以來(lái)，至今體細(xì)胞雜交已應(yīng)用于蔬菜育種并取得了一些成果，如“馬鈴薯×番茄”、“甘藍(lán)×白菜”、“胡蘿卜×香芹”等。我國(guó)學(xué)者在原生質(zhì)體融合方面做了很多工作，侯喜林等利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了不結(jié)球白菜胞質(zhì)雜種。司家剛等采用原生質(zhì)體非對(duì)稱融合技術(shù)獲得了胡蘿卜種內(nèi)胞質(zhì)雜種。連勇等應(yīng)用原生質(zhì)體電融合技術(shù)獲得了茄子近緣野生種與栽培種的種間體細(xì)胞融合四倍體再生植株。李省印等得到能再生出菌絲體和子實(shí)體的平菇種內(nèi)雜交株，其中選育出的“優(yōu)生1 號(hào)”品系，適應(yīng)性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、耐熱。
1.1.4 人工種子
    人工種子的成功不再需要每年配制雜交種，其“種皮”和“人工胚乳”可加入種子發(fā)芽生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗病蟲害、除草劑等特殊物質(zhì)。利用體細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生代替種子進(jìn)行田間播種，在蔬菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用上前景誘人。我國(guó)從1987 年開始將人工種子研究納入國(guó)家高新技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目，先后在胡蘿卜、苜蓿、芹菜等蔬菜的開發(fā)應(yīng)用上獲得了階段性成果，湯紹虎等以蕹菜小葉品種帶芽節(jié)段為繁殖體，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4％的海藻酸鈉包裹制作了人工種子；沈穎等以甘藍(lán)下胚軸為外植體誘導(dǎo)再生植株，并制作人工種子，為抱子甘藍(lán)及人工種子制作的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
1.2 分子標(biāo)記技術(shù)在蔬菜育種上的應(yīng)用
    遺傳標(biāo)記是基因型特殊的、易于識(shí)別的表現(xiàn)形式。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，使植物育種中的“間接選擇”成為可能，大大提高遺傳分析的準(zhǔn)確性和選育種的有效性，因而在遺傳育種領(lǐng)域愈來(lái)愈受到重視，將二者有機(jī)結(jié)合是今后育種工作的趨勢(shì)。分子標(biāo)記包括同工酶標(biāo)記和DNA 標(biāo)記。
1.2.1 同工酶標(biāo)記
    自70 年代以來(lái)，同工酶作為一種直接的基因產(chǎn)物，在作物遺傳育種中得到廣泛的應(yīng)用，相對(duì)于形態(tài)性狀標(biāo)記，它具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。首先它受環(huán)境因素影響較小，表觀出相對(duì)的穩(wěn)定性；其次多種同工酶可以在種子或幼苗中表達(dá)，有利于進(jìn)行早期鑒定。通過(guò)比較不同同工酶酶譜帶型的差異，對(duì)許多蔬菜作物的親緣進(jìn)化關(guān)系如西瓜、馬鈴薯、蘿卜、大白菜、花菜、茄子等進(jìn)行了研究。由于等位基因同工酶受共顯性等位基因控制，雜種表現(xiàn)互補(bǔ)型酶譜或雜種型酶譜，因此該技術(shù)適用于雜種純度檢測(cè)，目前已對(duì)甘藍(lán)、大白菜、黃瓜、西瓜、番茄等多種蔬菜進(jìn)行了純度鑒定。
1.2.2 DNA 分子標(biāo)記
    DNA 分子標(biāo)記是指電泳后能以一定的方法檢測(cè)到的反映基因組某種變異特征的DNA 片段。這種DNA 片段可以通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割，PCR 擴(kuò)增或兩者結(jié)合起來(lái)獲得。因此，DNA 標(biāo)記主要包括三大類：第一大類是基于DNA 分子雜交的方法，主要指限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，即RFLP。第二大類是基于PCR 技術(shù)的DNA 擴(kuò)增方法。它又分為兩類，一是使用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，主要指隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 技術(shù)；另一類標(biāo)記是采用特定引物或引物對(duì)擴(kuò)增的標(biāo)記，主要有SCAR、STS、微衛(wèi)星DNA 等。第三大類是PCR 與酶切相結(jié)合的方法，主要指AFLP 和CAPS 兩類。因?yàn)樯�物各種性狀的差異主要是遺傳物質(zhì)DNA 的差異造成，因而通過(guò)DNA 分子標(biāo)記可以直接檢測(cè)基因組的遺傳變異，它更能準(zhǔn)確揭示同一物種內(nèi)不同種、變種、品種、品系間個(gè)體的差異。DNA 作為分子標(biāo)記可以避免用形態(tài)和同工酶檢測(cè)遺傳變異所固有的許多問(wèn)題和傾向，它具有以下特點(diǎn)：（1）較高的可靠性，因?yàn)镈NA 標(biāo)記直接檢測(cè)遺傳物質(zhì)DNA，幾乎不受環(huán)境因素、取樣部位和發(fā)育階段的影響，不影響目的基因的表達(dá)，與不良性狀無(wú)必然的連鎖。（2）DNA 標(biāo)記在數(shù)量上幾乎沒(méi)有限制。（3）很多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能鑒別純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息，因此，DNA 分析技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等方面，而且在作物種質(zhì)資源研究中也具有重要意義，被認(rèn)為是鑒別品種、品系及分析種質(zhì)資源遺傳多樣性的有力工具。目前已對(duì)番茄、萵苣、辣椒、甘藍(lán)、胡蘿卜等多種蔬菜作物構(gòu)建了飽和或部分飽和的RFLP 遺傳圖譜。Landry 等曾發(fā)現(xiàn)一個(gè)RFLP 位點(diǎn)與抗霜霉病基__因是緊密連鎖，此外，與番茄的抗煙草花葉病毒基因，抗枯萎病基因，控制株型的基因（sp），影響果實(shí)成熟的基因（u）連鎖的RFLP 位點(diǎn)也先后被發(fā)現(xiàn)。在種質(zhì)資源研究方面，它在蕓薹屬、茄科等蔬菜作物的物種起源與進(jìn)化研究中曾發(fā)揮了很大作用。另外，在甜瓜、甘藍(lán)等蔬菜不同品種之間的親緣關(guān)系研究也有報(bào)道。在種質(zhì)資源親緣關(guān)系研究中也有顯著的成績(jī)，如蕓薹屬及其相鄰基因組，不同地域來(lái)源的芥菜、番茄、蔥屬、黃瓜等。目前已從分子水平對(duì)大白菜、芥菜、花椰菜、西瓜、番茄等品種（雜種）進(jìn)行了快速鑒定，在標(biāo)記輔助育種方面，RAPD技術(shù)更以其豐富的多態(tài)性和操作的簡(jiǎn)便性深受研究者的青睞，已構(gòu)建了甘藍(lán)、番茄、胡蘿卜、萵苣、辣椒等的遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)多個(gè)連鎖分子標(biāo)記如：與番茄抗TMV 基因連鎖；與西瓜抗枯萎病基因連鎖；與西瓜野生種質(zhì)資源耐冷性基因連鎖；與甘藍(lán)雄性不育基因連鎖的RAPD 標(biāo)記等等，利用這些連鎖標(biāo)記，能大大提高育種過(guò)程中的選擇效率，減少不必要的人力和物力。

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